內(nèi)毒素的去除方法
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器皿中內(nèi)毒素的去除:
a.干熱法
? 適用對象：耐熱物品如玻璃制品、金屬制品等生產(chǎn)過程中所用的容器
? 處理方法： 180℃3～ 4h 或 250℃ 30min～ 2h
? 注意事項(xiàng)：
? 1.在干烤前，被加熱的玻璃器皿上最好不要有水珠，否則可能會使玻璃器皿損壞。
? 2.烘烤結(jié)束后，玻璃器皿不要馬上從電熱烘箱中拿出，要等溫度適度降低之后才可以拿出，以免因溫差太大而造成玻璃器皿損壞。
? 3.器皿上不能含有紙質(zhì)或塑料制品，以免烘烤時(shí)燃燒或熔化。
b.化學(xué)降解法
? 適用對象：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的內(nèi)毒素。
? 處理方法：常用3～5％雙氧水、重鉻酸鉀硫酸清潔液（重鉻酸鉀∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 ）、0.1M HCl或0.1 M NaOH浸泡去除。一般處理4h以上。
? 注意事項(xiàng)：佩戴防護(hù)用具，防止皮膚直接接觸。
溶液中內(nèi)毒素的去除
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方法 |
原理 |
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
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液相分離法 |
一些去污劑，如Triton X-114，脫氧膽酸鈉能夠和內(nèi)毒素的脂質(zhì)部分結(jié)合，通過液相分離的方法萃取內(nèi)毒素從而使后者有效地去除。 |
對內(nèi)毒素的去除率高，且不影響有效成份的活性。該法簡單高效、價(jià)格低廉、適合大規(guī)模應(yīng)用，在我們?nèi)粘５牡鞍准兓休^為常用。 |
去內(nèi)毒素后的樣品會有微量去污劑的殘留。 |
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分子篩法 |
分子篩是利用凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小進(jìn)行分離的一種方法。由于蛋白質(zhì)和內(nèi)毒素的分子量有較大差別，因此利用分子篩可以有效去除內(nèi)毒素。 |
去除效果明顯 |
每次處理量小，處理時(shí)間較長。 |
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離子交換色譜法 |
當(dāng)溶液pH＞2時(shí)，內(nèi)毒素帶有負(fù)電荷。因此內(nèi)毒素與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強(qiáng)結(jié)合。柱上的內(nèi)毒素可在洗脫目標(biāo)蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。 |
成本低，吸附容量大 |
但不適合于溶液中存在其它帶負(fù)電荷物質(zhì)的情況。 |
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親和色譜法 |
將適當(dāng)?shù)呐浠梯d于色譜基質(zhì)上合成出親和介質(zhì)，使它特異性結(jié)合內(nèi)毒素。GenScript將多粘菌素B（PMB）偶聯(lián)于Sepharose FF 上，以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素。 |
高效能、高選擇性 |
相對成本較高。 |
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超濾法 |
由于內(nèi)毒素具有較大的相對分子質(zhì)量，因此可選用超濾膜去除溶液中的內(nèi)毒素。 |
操作簡單，處理量大 |
操作過程中的壓力較高。 不適合含有較大相對分子質(zhì)量成份的樣品。因?yàn)樵诔嵩耐瑫r(shí)會阻留或吸附樣品中的有效成份，使產(chǎn)品收率大受影響。 |
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吸附法 |
活性炭用于去除內(nèi)毒素是由于內(nèi)毒素的相對分子質(zhì)量較大。適合于組分較為簡單的小分子的溶液中或水中去除內(nèi)毒素。活性炭常用量為0.1%～0.5%。 |
成本低，處理量大。 |
活性炭的選擇性較差，易吸附有效成份，純化后溶液中的殘余活性炭不易去除，且自身可能含有的重金屬造成樣品污染，因此目前很少使用 |
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蒸餾法 |
此方法可用于生產(chǎn)去熱源水，作為注射用水或洗滌水。 |
去除效果明顯 |
成本較高 |
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疏水層析法 |
內(nèi)毒素的脂肪A 部份有很強(qiáng)的疏水性, 但在高鹽下會凝集, 無法掛上疏水層析柱。因此可選擇能結(jié)合目標(biāo)蛋白的疏水介質(zhì)去除內(nèi)毒素 |
適用于高鹽濃度的樣品 |
目前技術(shù)不夠成熟，還需要進(jìn)一步探索 |
但是，各種去內(nèi)毒素的方法不是孤立的，可以相互結(jié)合使用。 比如，如果液相分離法得到的蛋白內(nèi)毒素水平未達(dá)標(biāo)，可以接著利用分子篩法進(jìn)一步去除內(nèi)毒素。
作為目前去內(nèi)毒素常用的方法，液相分離法的注意事項(xiàng)值得我們重視
1.液相分離方法應(yīng)用于蛋白純化中內(nèi)毒素的去除
a.目的蛋白上樣后，用預(yù)冷的基礎(chǔ)溶液+1% Triton X-114緩慢淋洗柱子，直至A280數(shù)值穩(wěn)定不變；
b.用預(yù)冷的去內(nèi)毒素基礎(chǔ)溶液淋洗柱子，直至A280數(shù)值達(dá)到基線，穩(wěn)定不變；
c.用各梯度去內(nèi)毒素的洗脫液洗脫，收集各洗脫液于去內(nèi)毒素的收集管中。
d.此方法適用廣泛，如我們常用Ni柱、GST柱和離子交換柱等純化。
e.純化過程應(yīng)盡量在潔凈的環(huán)境下進(jìn)行，純化時(shí)間不宜過長。
f.所用的吸管、槍頭等器材應(yīng)為經(jīng)去內(nèi)毒素處理的。
2.液相分離法應(yīng)用于大量樣品中內(nèi)毒素的去除
a.在大量蛋白樣品中加入終濃度為 1% 的Triton X-114 ，充分混勻 ，冰浴 5min ，使之成為一相 ；
b.升溫超過其濁點(diǎn) 21 ℃，37 ℃孵育 ，觀察分層情況；
c.待溶液中出現(xiàn)明顯分層后 ，室溫下 12000r/min ，離心5min ，吸取上清液 ；
d.為達(dá)到較好的去除效果，可以重復(fù) 2 次。
e.如果樣品內(nèi)毒素含量較高，可以提高Triton X-114濃度至2%。
f.如果升溫至37 ℃后，分層不明顯或比較慢，可以升溫至56 ℃孵育。
g.本方法不適用于去除膜蛋白中的內(nèi)毒素. 蘭州去離子水設(shè)備，蘭州水處理設(shè)備，超純水設(shè)備，醫(yī)用GMP純化水設(shè)備。銀川純水設(shè)備
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