內毒素的去除方法
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器皿中內毒素的去除:
a.干熱法
? 適用對象：耐熱物品如玻璃制品、金屬制品等生產過程中所用的容器
? 處理方法： 180℃3～ 4h 或 250℃ 30min～ 2h
? 注意事項：
? 1.在干烤前，被加熱的玻璃器皿上最好不要有水珠，否則可能會使玻璃器皿損壞。
? 2.烘烤結束后，玻璃器皿不要馬上從電熱烘箱中拿出，要等溫度適度降低之后才可以拿出，以免因溫差太大而造成玻璃器皿損壞。
? 3.器皿上不能含有紙質或塑料制品，以免烘烤時燃燒或熔化。
b.化學降解法
? 適用對象：主要用于去除玻璃、塑料和其它高分子材料器皿上的內毒素。
? 處理方法：常用3～5％雙氧水、重鉻酸鉀硫酸清潔液（重鉻酸鉀∶硫酸∶水常用配比1∶1∶10 或1∶2∶8 ）、0.1M HCl或0.1 M NaOH浸泡去除。一般處理4h以上。
? 注意事項：佩戴防護用具，防止皮膚直接接觸。
溶液中內毒素的去除
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方法 |
原理 |
優點 |
缺點 |
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液相分離法 |
一些去污劑，如Triton X-114，脫氧膽酸鈉能夠和內毒素的脂質部分結合，通過液相分離的方法萃取內毒素從而使后者有效地去除。 |
對內毒素的去除率高，且不影響有效成份的活性。該法簡單高效、價格低廉、適合大規模應用，在我們日常的蛋白純化中較為常用。 |
去內毒素后的樣品會有微量去污劑的殘留。 |
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分子篩法 |
分子篩是利用凝膠的網狀結構，根據分子大小進行分離的一種方法。由于蛋白質和內毒素的分子量有較大差別，因此利用分子篩可以有效去除內毒素。 |
去除效果明顯 |
每次處理量小，處理時間較長。 |
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離子交換色譜法 |
當溶液pH＞2時，內毒素帶有負電荷。因此內毒素與陰離子交換介質Q或DEAE Sepharose Fast Flow有較強結合。柱上的內毒素可在洗脫目標蛋白后用高鹽緩沖液或NaOH去除。 |
成本低，吸附容量大 |
但不適合于溶液中存在其它帶負電荷物質的情況。 |
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親和色譜法 |
將適當的配基固載于色譜基質上合成出親和介質，使它特異性結合內毒素。GenScript將多粘菌素B（PMB）偶聯于Sepharose FF 上，以此介質特異性吸附內毒素。 |
高效能、高選擇性 |
相對成本較高。 |
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超濾法 |
由于內毒素具有較大的相對分子質量，因此可選用超濾膜去除溶液中的內毒素。 |
操作簡單，處理量大 |
操作過程中的壓力較高。 不適合含有較大相對分子質量成份的樣品。因為在除去熱原的同時會阻留或吸附樣品中的有效成份，使產品收率大受影響。 |
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吸附法 |
活性炭用于去除內毒素是由于內毒素的相對分子質量較大。適合于組分較為簡單的小分子的溶液中或水中去除內毒素。活性炭常用量為0.1%～0.5%。 |
成本低，處理量大。 |
活性炭的選擇性較差，易吸附有效成份，純化后溶液中的殘余活性炭不易去除，且自身可能含有的重金屬造成樣品污染，因此目前很少使用 |
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蒸餾法 |
此方法可用于生產去熱源水，作為注射用水或洗滌水。 |
去除效果明顯 |
成本較高 |
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疏水層析法 |
內毒素的脂肪A 部份有很強的疏水性, 但在高鹽下會凝集, 無法掛上疏水層析柱。因此可選擇能結合目標蛋白的疏水介質去除內毒素 |
適用于高鹽濃度的樣品 |
目前技術不夠成熟，還需要進一步探索 |
但是，各種去內毒素的方法不是孤立的，可以相互結合使用。 比如，如果液相分離法得到的蛋白內毒素水平未達標，可以接著利用分子篩法進一步去除內毒素。
作為目前去內毒素常用的方法，液相分離法的注意事項值得我們重視
1.液相分離方法應用于蛋白純化中內毒素的去除
a.目的蛋白上樣后，用預冷的基礎溶液+1% Triton X-114緩慢淋洗柱子，直至A280數值穩定不變；
b.用預冷的去內毒素基礎溶液淋洗柱子，直至A280數值達到基線，穩定不變；
c.用各梯度去內毒素的洗脫液洗脫，收集各洗脫液于去內毒素的收集管中。
d.此方法適用廣泛，如我們常用Ni柱、GST柱和離子交換柱等純化。
e.純化過程應盡量在潔凈的環境下進行，純化時間不宜過長。
f.所用的吸管、槍頭等器材應為經去內毒素處理的。
2.液相分離法應用于大量樣品中內毒素的去除
a.在大量蛋白樣品中加入終濃度為 1% 的Triton X-114 ，充分混勻 ，冰浴 5min ，使之成為一相 ；
b.升溫超過其濁點 21 ℃，37 ℃孵育 ，觀察分層情況；
c.待溶液中出現明顯分層后 ，室溫下 12000r/min ，離心5min ，吸取上清液 ；
d.為達到較好的去除效果，可以重復 2 次。
e.如果樣品內毒素含量較高，可以提高Triton X-114濃度至2%。
f.如果升溫至37 ℃后，分層不明顯或比較慢，可以升溫至56 ℃孵育。
g.本方法不適用于去除膜蛋白中的內毒素. 蘭州去離子水設備，蘭州水處理設備，超純水設備，醫用GMP純化水設備。銀川純水設備
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